Tecnología Tricorder: PicoRuler: reglas moleculares para microscopía de alta resolución

Los últimos métodos de microscopía de superresolución alcanzan ahora una resolución óptica del orden de unos pocos nanómetros. Esto corresponde a la resolución en el rango de tamaño de las moléculas celulares. Sin embargo, todavía no ha sido posible verificar la precisión lograda realmente en los componentes celulares, como los complejos multiproteicos, porque no existían sistemas de referencia biomoleculares que pudieran marcarse con colorantes en lugares definidos con precisión a una distancia de unos pocos nanómetros.

Un equipo dirigido por la Dra. Gerti Bilyeu y el profesor Markus Sauer del Centro Rudolf Virchow, el Centro de Bioimagen Integrativa y Traslacional de la Universidad Julius Maximilians (JMU) de Würzburg en Baviera, Alemania, ha supuesto un punto de inflexión. En la revista Advanced Materials presentan nuevas reglas moleculares biocompatibles, PicoRulers (reglas ópticas para calibración de imágenes basadas en proteínas).

Utilizando la expansión del código genético y la química de clics, el equipo construyó con éxito estas reglas moleculares personalizadas. Se pueden utilizar como estructuras de referencia biomoleculares precisas en microscopía de fluorescencia.

Arquitectura PicoRuler basada en PCNA para microscopía de superresolución inferior a 10 nm. A) Representación del diseño de la regla PCNA, que muestra las posiciones de tres fluoróforos idénticos a intervalos de 6 nm. Esto se logró mediante la epitaxia bioortogonal de ncAA, que la GCE introdujo específicamente en el sitio de PCNA. Como muestra de referencia utilizamos PCNA etiquetado con DOL ≈0,4. B) SDS-PAGE que muestra la pureza de WT PCNA después de cada paso de purificación. L: escalera de proteínas, His: después de la cromatografía de afinidad con níquel, Strep-Trap: después de la cromatografía de afinidad Strep-tag y SEC: después de la cromatografía de exclusión por tamaño. La banda del monómero PCNA está marcada con un triángulo rojo. C) Imagen de PCNA-6 (S186Norb) mediante TEM con tinción negativa con acetato de uranilo. D) Cromatograma SEC de PCNA-6 (S186Norb) después del marcado con H-Tet-Cy5, que confirma la conjugación exitosa de fluoróforos con la proteína PCNA. La fracción que contiene el PicoRuler etiquetado se muestra en azul. Barra de escala 5 nm (c) – Materiales avanzados

Una obra maestra tecnológica: precisión a nivel molecular

Los PicoRulers se basan en la proteína de tres partes PCNA (antígeno nuclear de células proliferantes), que desempeña un papel clave en la replicación y reparación del ADN. Al insertar cuidadosamente aminoácidos no naturales en ubicaciones definidas con precisión, esta proteína se ha modificado de tal manera que puede hacer clic en tintes fluorescentes u otras moléculas específicamente con un error de unión mínimo.

Esto permite a los investigadores probar la precisión de los últimos métodos de microscopía de superresolución con una resolución sin precedentes en una biomolécula celular definida con precisión.

Markus Sauer se entusiasma: «La capacidad de analizar estructuras biológicas reales a un nivel inferior a 10 nm representa una nueva era en la obtención de imágenes biológicas. En comparación con las macromoléculas sintéticas utilizadas anteriormente, nuestros PicoRulers no sólo son biocompatibles. También proporcionan una precisión incomparable para realizar pruebas. Exactitud bajo condiciones realistas.

Abriendo la puerta al estudio de procesos complejos en las células

La aplicación de esta tecnología se extiende más allá de los límites tradicionales de la microscopía. «Nuestros PicoRulers no son sólo una herramienta para realizar mediciones más precisas, sino que también abren la puerta a una investigación más profunda y detallada de los complejos procesos que ocurren dentro de nuestras células», explica Gerti Bilyeu.

Evaluación fotofísica de PicoRulers y origami de ADN basados ​​en PCNA. a, b) Imágenes dSTORM seleccionadas de PicoRulers con triple etiqueta (DOL ≈ 3.0) y (b) origami de ADN (DOL ≈ 3.0) con distancias interfluoróforas de 6 nm, junto con sus muestras de referencia con etiqueta única (ref). Si bien cada origami de ADN contiene un único fluoróforo, la muestra de referencia de PCNA muestra un DOL ≈0,4 y, por lo tanto, también contiene moléculas de PCNA sin etiquetar y con doble etiqueta (tamaño de píxel de 2 nm). Barras de escala, 10 nm. c) Ocurrencia relativa de tiempos de vida OFF, número de estados (eventos) detectados de PicoRulers individuales en experimentos dSTORM y número de eventos (localizaciones) detectados por cuadro en función del tiempo (análisis de huellas dactilares). d) Imágenes FLIM de PicoRulers etiquetados con H-Tet-Cy5 (la referencia etiquetada individualmente se muestra en gris y un PicoRuler medido con triple clic se muestra en un cuadro magenta) mediante imágenes confocales TCSPC en tampón de conmutación de fotos a una intensidad de irradiación de ≈ 2,5 kWcm-2. Para minimizar el fotoblanqueo del fluoróforo, se registraron imágenes FLIM con un tiempo de integración de 25 μs para cada píxel. No se aplicó ningún umbral de gravedad. Barras de escala, 2 μm. E) Caídas de fluorescencia promedio de PCNA PicoRulers etiquetados con uno (gris) o tres (púrpura) fluoróforos Cy5. f) Relaciones Nc/Nl,av determinadas para moléculas de PCNA de referencia con etiqueta única y PicoRulers con etiqueta triple en experimentos de resistencia a la recolección de fotones (n = 13) – Materiales avanzados.

Gran potencial para futuras aplicaciones

Un mayor desarrollo de PicoRulers puede cambiar las imágenes biológicas y médicas con resolución molecular a largo plazo. Por primera vez, ha sido posible validar y mejorar el potencial de resolución de nuevos métodos de microscopía de superresolución en muestras biológicas. Esto lo convierte en una herramienta valiosa para dilucidar la organización molecular y la interacción de biomoléculas en las células en el futuro.

PCNA como nanoescala basada en proteínas para imágenes de fluorescencia por debajo de 10 nmMateriales Avanzados (Acceso Abierto)

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