En un estudio reciente publicado en Comunicaciones de la naturalezaY el Un equipo de investigadores evaluó las diferencias entre los paneles de luz gaussiana y reticulada en relación con la homogeneidad del haz, la resolución axial, la resolución transversal y el fotoblanqueo mediante cálculos y mediciones experimentales en celdas fijas.
estancia: Análisis cuantitativo de diferentes patrones aplicados en microscopía de lámina de luz retiniana. Haber de imagen: Micha Weber/Shutterstock.com
Los investigadores demostraron que se pueden modificar diferentes patrones de iluminación retinal óptica para resaltar la resolución axial o la segmentación óptica. También presentaron un método para obtener imágenes de alta resolución y bajo ruido mediante la integración espectral de adquisiciones sucesivas de diferentes patrones de rejilla con propiedades ópticas idénticas.
Las capacidades de los microscopios de placa de luz
Las imágenes de materiales biológicos de varios tamaños, desde átomos individuales hasta organismos completos, se obtienen mediante microscopía de hoja de luz.
Los microscopios de placa óptica mejoran la velocidad de obtención de imágenes y reducen la fototoxicidad. Solo un nivel fino de la muestra se ilumina durante la microscopía de hoja de luz. Esto elimina la iluminación desenfocada, reduce la decoloración de la imagen y mejora la relación señal-ruido (SNR) en comparación con la fluorescencia adhesiva y la microscopía óptica.
Los límites del microscopio de placa de luz
La resolución axial del microscopio óptico de papel y el campo de visión visible son inversamente proporcionales entre sí cuando están equipados con rayos gaussianos. Al adoptar patrones de iluminación con estructura coaxial, los paneles basados en abrazaderas fotónicas brindan una mejor resolución axial y homogeneidad del haz que los haces gaussianos. Estos beneficios se obtienen a expensas de que la muestra absorba más luz y tenga un patrón de iluminación menos restringido axialmente.
Usando lentes cilíndricas, las técnicas de microscopía de hoja óptica más eficientes enfocan un haz gaussiano en una placa estirada lateralmente. Este enfoque tiene una compensación inherente entre la longitud y el grosor de la extensión de la hoja ligera. Se ofrece una mayor división óptica y resolución axial mediante el uso de hojas fotónicas gaussianas más delgadas, pero a expensas de una longitud de propagación más corta y un campo de visión más estrecho.
Estrategias para mejorar la resolución axial y la segmentación óptica en microscopios de placas ópticas
Las láminas de luz estructuradas, como los haces de Bessel y las rejillas fotónicas, se pueden utilizar para superar las limitaciones de los microscopios fotovoltaicos.
Los haces híbridos que consisten en haces no dispersivos y gaussianos se pueden producir con un patrón de iluminación restringido en un solo plano.
Según los objetivos de la imagen, el usuario puede ajustar el patrón de iluminación para mejorar la longitud de propagación, la segmentación óptica o la resolución axial cambiando el ancho de la envolvente de atenuación en la muestra.
Evaluación de los patrones de iluminación óptica de la retina para mejorar la resolución axial y la segmentación óptica
Las sinapsis ópticas tienen cinturas de haz y funciones de transferencia óptica (OTF) idénticas en comparación con los haces gaussianos. El rendimiento del equipo que utiliza abrazaderas ópticas cuadradas y haces gaussianos enfocados es idéntico.
alguna cosa y otros. evaluó e informó los beneficios y los inconvenientes de las láminas de luz reticular frente a los haces gaussianos. Hicieron observaciones reales sobre perlas de difracción limitada, arquitecturas celulares y modelos ópticos. Los investigadores demostraron cómo se pueden modificar las láminas de luz estructuradas para que actúen de manera similar al sistema gaussiano ajustando la envolvente que rodea la muestra.
alguna cosa et al. Se evaluaron OTF y la correlación del plano de Fourier (FPC) para analizar las relaciones de frecuencia espacial dentro de la imagen en diferentes puntos a lo largo de la longitud de propagación del haz. También examinaron hojas ligeras de longitudes de extensión similares.
Resultados de la investigacion
En este documento, se examinan las ventajas y desventajas entre diferentes patrones de haz utilizados en la microscopía de hoja óptica mediante modelos de simulación y observaciones prácticas. Se utilizaron comparaciones de FWHM en espacio real, comparaciones de OTF en espacio de frecuencia y FPC para evaluar el rendimiento del haz mientras se obtienen imágenes de diferentes estructuras subcelulares en células vivas y estacionarias con diferentes densidades de emisor y relaciones señal-ruido.
En comparación con los haces gaussianos o planos, los haces de rejilla cuadrada y los haces de rejilla hexagonal superaron sistemáticamente la resolución axial y la homogeneidad del haz a lo largo de la ruta de propagación.
Al ajustar los haces de celosía para que sean más gaussianos, se pueden adaptar diferentes patrones de celosía para escenarios de imágenes específicos. Las desventajas de los haces de malla plana, cuadrada y hexagonal sobre los haces gaussianos incluyen una mayor excitación fuera del plano y una segmentación óptica reducida. Esto da como resultado una pérdida de resolución lateral y un aumento en el blanqueamiento de la imagen en muestras vivas y muestras fluorescentes al aumentar el ruido de disparo del desenfoque de fondo.
En aplicaciones donde la resolución axial y la concordancia son menos importantes que el fotoblanqueo, se debe preferir un haz gaussiano a haces de rejilla plana o hexagonal con la misma longitud de propagación e intensidad máxima. Si la resolución axial y la compatibilidad del haz son importantes, se deben usar abrazaderas hexagonales. Se pueden usar diferentes fotoelectrones de celosía para equilibrar estos parámetros en función de las necesidades experimentales.
referencia
Shea, Y., Dugerd, TA y Legant, WR (2022). Análisis cuantitativo de diferentes patrones aplicados en microscopía de lámina de luz retiniana. Comunicaciones de la naturalezaY el 13(1), 4607. https://www.nature.com/articles/s41467-022-32341-w
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