Un nuevo enfoque de diagnóstico multiplexado para COVID-19

El síndrome respiratorio agudo severo 2 por coronavirus (SARS-CoV-2), responsable de la pandemia del coronavirus 2019 (COVID-19), es altamente contagioso y contagioso. Para detectar adecuadamente las diferentes etapas de la infección viral, se necesitan diferentes métodos de diagnóstico.

Un grupo de investigadores internacionales ha investigado la detección multiplexada de COVID-19 utilizando tecnología de molécula única. El uso de un ensayo sin enzimas de una sola molécula para la detección multiplexada tiene muchos beneficios, incluida la flexibilidad y la capacidad de identificar eficazmente muestras de bajo volumen. Los investigadores han desarrollado una plataforma para detectar el virus directamente de la muestra del paciente, así como la respuesta inmune a través de anticuerpos como IgG e IgM.

Una copia preimpresa del trabajo de investigación está disponible en medRxiv* Servidor mientras el artículo está sujeto a revisión por pares.

Herramientas de diagnóstico actuales

Las pruebas de diagnóstico actuales utilizadas para las infecciones virales incluyen la transcripción inversa en tiempo real: reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) y el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). Estas pruebas requieren varios pasos e incluyen amplificación de señal basada en enzimas; El período de tiempo para estas pruebas de diagnóstico puede ser muy largo, y esto puede hacer que sea un poco incómodo confiar en el uso de estas pruebas durante una pandemia.

La pandemia requirió la dependencia de los sistemas de salud como nunca antes. Para garantizar que las personas estén seguras para regresar al trabajo o participar en otras actividades sociales después de que se desarrollen los síntomas, se requieren pruebas de PCR de COVID-19 en grandes cantidades en un período corto de tiempo. Como resultado, los nuevos métodos de diagnóstico pueden ser más efectivos durante una pandemia y para tratar una infección viral como el SARS-CoV-2.

Detección monomolecular de anticuerpos RBD. (A) Esquema de la prueba serológica diagnóstica. Las muestras de suero se incuban con antígeno viral conjugado con biotina (RBD) y se cargan en un cubreobjetos recubierto con PEG, activador de estreptavidina. Se agrega un multiplicador de anticuerpos IgG (rojo) e IgM (azul claro) marcado con fluorescencia a la celda de flujo y se obtienen imágenes. (B) Se incubaron anticuerpos humanos anti-RBD a concentraciones específicas con biotina-RBD y se detectaron mediante anticuerpos IgG anti-humanos marcados con fluorescencia. Hay anticuerpos mínimos a concentraciones picomolares. Ambos ejes están en una escala logarítmica y el punto de datos del anticuerpo RBD no es una escala. (C) Las muestras de suero de portadores o sujetos no infectados se diluyeron 1: 2500 y se analizaron como se describe en B para detectar la presencia de anticuerpos IgG RBD en el suero de los sujetos. El diagrama de caja muestra el número de puntos por campo de visión para todos los campos de visión fotografiados para cada muestra. Los valores medios para cada grupo se compararon mediante la prueba t, valor p <0,05. (D) Comparación de detección de molécula única y ELISA de anticuerpos RBD. Se realizaron imágenes de una sola molécula y ELISA contra anticuerpos RBD en las mismas muestras. Las señales de cada ensayo se normalizaron en comparación con las muestras de suero negativas. Las imágenes de una sola molécula proporcionan una mayor sensibilidad y rango dinámico en la detección de anticuerpos RBD en el suero sanguíneo. (EF) Suero de sujetos con enfermedad COVID-19 activa (azul), convalecientes (rojo) o no infectados (gris), diluido 1: 2500, incubados con biotina-RBD y cargados en una superficie cubierta con estreptococo. Se tomaron imágenes y se cuantificaron anticuerpos IgM (E) o IgG (F) marcados con fluorescencia.

Nuevos enfoques de diagnóstico

El desarrollo de nuevos métodos de diagnóstico ha aumentado en respuesta a las demandas costosas, de múltiples pasos y que consumen mucho tiempo dentro de los métodos de diagnóstico actuales. Los nuevos métodos de diagnóstico desarrollados incluyen: transcripción inversa acoplada con nanoporos, amplificación térmica, métodos basados ​​en CRISPR y enfoques basados ​​en secuenciación de próxima generación, así como investigación para optimizar el tiempo de RT-PCR a través del hilado térmico del plasma.

Aunque estos nuevos métodos de diagnóstico tienen como objetivo mejorar el tiempo de prueba, así como el costo y la accesibilidad, todavía se basan principalmente en procesos enzimáticos.

Tecnología de imágenes de base única

La tecnología de imagen única ha mejorado a lo largo de los años, pasando de tener una técnica de secuenciación de mayor rendimiento a ser lo suficientemente sensible para detectar proteínas.

Junto con otros investigadores, los autores de este artículo demostraron que la microscopía de reflexión interna total (TIRF) es capaz de detectar un solo fluoróforo adherido a una superficie sólida mientras proporciona multiplexación espacial y espectral y detección cuantitativa de partículas.

Dentro de este trabajo de investigación, los científicos presentan una demostración del concepto de capturar una superficie de estreptavidina-biotina, con marcaje fluorescente, para detectar ARN viral y anticuerpos antivirales a través de imágenes de una sola molécula. Las pruebas en muestras han demostrado que es probable que estos métodos de diagnóstico sean más efectivos que los métodos enzimáticos convencionales para detectar infecciones virales debido a su alta escalabilidad y su mínima dependencia de las enzimas.

Los investigadores desarrollaron la detección de ARN por microscopía TIRF a través de los siguientes tres pasos. El primer paso implica la hibridación en tubo, que consiste en hibridar el ARN viral con dos tipos de sondas de ADN, incluidas las sondas marcadas con biotina y las sondas de detección marcadas con fluoróforo.

El segundo paso es la fijación, en la que las muestras se agregan a una celda de flujo con un cubreobjetos recubierto de estreptavidina, lo que permite que los complejos de hibridación sean capturados por la reacción de biotina-estreptavidina.

El tercer y último paso implica la formación de imágenes, mediante el cual los complejos se pueden obtener con un microscopio TIRF, y este método permite que cada punto de la imagen se corresponda con una única molécula de ARN viral.

Importancia para COVID-19

Utilizando tecnología de imágenes de base única, los investigadores han desarrollado un método para detectar ARN viral que se puede utilizar para detectar el SARS-CoV-2 en diferentes etapas de su ciclo de vida dentro del cuerpo. Los investigadores pudieron desarrollar un enfoque de tres pasos utilizando microscopía TIRF para obtener imágenes y detectar partículas individuales de ARN viral.

Aunque el nuevo enfoque de diagnóstico detectó anticuerpos de forma más eficaz que el ensayo ELISA clásico, la sensibilidad de la hibridación de una sola molécula puede no ser tan eficaz como los ensayos de PCR basados ​​en amplificación. Sin embargo, al desarrollar un nuevo método con un mayor nivel de sensibilidad a través de la firma cinemática de una sola molécula, esta limitación puede superarse.

Además de proporcionar una base de datos de investigaciones que se puede utilizar para detectar el SARS-CoV-2, el diseño es lo suficientemente flexible como para detectar patógenos adicionales.

Dada la variedad de variantes que han surgido durante la reciente pandemia de COVID-19, esta prueba genética de molécula única ofrece la mayor posibilidad de detección múltiple de más de una variante.

*Nota IMPORTANTE

medRxiv Publica informes científicos preliminares que no han sido revisados ​​por pares y, por lo tanto, no deben considerarse concluyentes, que dirigen la práctica clínica / comportamiento relacionado con la salud, ni deben considerarse información estática.