La pandemia de la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19), que fue causada por la aparición del síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 (SARS-CoV-2), ha enfatizado la necesidad de desarrollar rápidamente reactivos para ayudar a comprender la patogénesis viral, las respuestas del huésped y desarrollar diagnósticos apropiados.
estancia: Desarrollo de un anticuerpo monoclonal para detectar proteínas del SARS-CoV-2. Haber de imagen: ustas77777777/Shutterstock.com
antecedentes
El SARS-CoV-2 es un virus de ADN monocatenario (ssRNA) de sentido positivo que tiene un genoma de aproximadamente 30 kilobases (kB). Las proteínas no estructurales (Nsp) están codificadas por dos tercios del extremo 5′ del genoma viral que desempeña un papel en la replicación viral después de la autoescisión por proteasas. Las cuatro proteínas estructurales del SARS-CoV-2 incluyen envoltura (E), espiga (S), transmembrana (M) y nucleocápside (N), todas codificadas por el último tercio del genoma.
Las proteínas N y S del SARS-CoV-2 se dirigen principalmente al desarrollo de terapias basadas en anticuerpos monoclonales (mAb) para neutralizar la infección viral. Aunque actualmente se encuentran disponibles muchos anticuerpos policlonales (pAb) derivados de suero contra el SARS-CoV-2, hay muchos menos mAbs disponibles.
Mientras que los pAb son mezclas de anticuerpos capaces de unirse a múltiples epítopos de un solo antígeno, los mAbs pueden reconocer solo un único epítopo. La falta de mAbs es una barrera importante en la evaluación de las respuestas celulares a vacunas y tratamientos.
nuevo Revista de Biología Molecular El estudio tuvo como objetivo generar, caracterizar y mejorar Abs contra nueve proteínas SARS-CoV-2, que incluían proteínas estructurales, no estructurales y accesorias.
sobre estudiar
El presente estudio involucró la expresión de proteínas del SARS-CoV-2 como la glutatión S-transferasa (GST) o las proteínas de fusión de la proteína de unión a maltosa (MBP) en células de Escherichia coli BL21 (DE3) seguidas de su purificación. A continuación, los clones de fagos fab, que eran específicos de las proteínas SARS-CoV-2, se aislaron de las bibliotecas de anticuerpos presentadores de fagos y se etiquetaron.
Las proteínas de inmunoglobulina G (IgG) se expresaron con los vectores pSCSTa-hIg1 y pSCST1-hk, después de lo cual los vectores de cadena ligera y pesada se transfectaron en células HEK293F y se purificaron. Luego se usó un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) para determinar la cinética de unión del anticuerpo, que fue seguido por análisis de inmunotransferencia y transferencia Western.
Resultados
Se encontró que un total de 18 clones de fagos fabulosos se unían a nueve proteínas del SARS-CoV-2. La mayoría de las IgG se asociaron con valores de concentración de unión efectiva (EC50) de la mitad del máximo en la nanoescala de un solo dígito, excepto 16684, 16658 y 16485 IgG.
Los resultados de la cinética de unión mediante interferometría binaria (BLI) fueron similares a los valores de EC50 medidos por ELISA. Sin embargo, no se pudieron obtener señales de unión para 16658 o 16684 IgG con Nsp7 o Nsp15.
Además, los mAbs pueden detectar proteínas que se han desnaturalizado mediante transferencia Western. Los resultados de los ensayos de inmunofluorescencia mostraron que los mAbs contra Orf3b (15887), Nsp12 (15884) y Nsp1 (15497) podían identificar objetivos virales intracelulares.
Se observó un patrón de puntos en 15497 y 15498 Abs que reconocían dos epítopos diferentes en Nsp1. También se observó una tinción de puntos similar para Nsp12 y Orf3b; Sin embargo, no se pudo visualizar ningún objetivo usando un anticuerpo contra Nsp8.
También se determinaron los patrones de localización subcelular de Orf3b y Nsp12. Con este fin, se observó la expresión de Orf3b tanto en células que expresan N como en las que no expresan. Se descubrió que Orf3b mostraba un patrón de tinción de puntos dentro del citoplasma de las células infectadas, mientras que Nsp12 se observó como grupos de puntos rodeados por un fondo tenue y ubicados en la región perinuclear de las células infectadas.
Conclusiones
En conjunto, el estudio actual indica que la disponibilidad de mAbs ayuda a caracterizar las interacciones virales-huésped, así como a proporcionar una mejor comprensión de la fisiopatología de COVID-19. Los resultados del estudio también destacan la importancia de apuntar a distintos epítopos para evaluar las diferentes funciones de distintas regiones de las proteínas del SARS-CoV-2.
Journal reference:
- Mishra, N., Teyra, J., Boytz, R., et al. (2022). Development of monoclonal antibodies to detect for SARS-CoV-2 proteins. Journal of Molecular Biology. doi:10.1016/j.jmb.2022.167583.
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